ДНК – изоляция и разделение

Во многих случаях желательно изолировать их ДНК от клеток или вирусных частиц . Конечно, существует ряд методов выделения ДНК , каждый из которых требует высвобождения достаточного количества биологического материала, выделения ДНК и отделения от супрамолекулярных структур, после чего образец необходимо очистить и, при необходимости, сконцентрировать.

Важным этапом является высвобождение ДНК из клеток, которое в клетках животных осуществляется с использованием детергентов ( поверхностно-активных веществ ), разрушающих мембраны. Для клеток с клеточной стенкой это сложнее и необходимо использовать лизоцимы, например(на стенке бактериальной клетки) или механическое разрушение. Когда дело доходит до очистки клеточных экстрактов, обычно необходимо избавиться от белков, которые являются основным источником загрязнения образцов. Можно использовать протеазы, но часто белки осаждаются фенолом и хлороформом , тогда как нуклеиновые кислоты остаются в растворе и затем могут быть осаждены, например, этанолом

Выделение ДНК часто сопровождается разделением молекул желаемого вида. Может быть желательным отделение, например, плазмид от геномной ДНК бактерий, что выполняется относительно просто центрифугированием при правильно установленных параметрах, обычно денатурацией и последующей ренатурацией. Для более тонкого распределения по размеру и топологии ДНК часто используется электрофорез на агарозном (или в случае очень малых молекул полиакриламида ) геле. В случае очень больших фрагментов ДНК используется так называемый импульсный гель-электрофорез . Затем из геля можно перенести ДНК на нитроцеллюлозную мембрану с помощью так называемогоСаузерн-блоттинг . Другой метод разделения ДНК – центрифугирование в градиенте плотности , обычно в градиенте хлорида цезия – этот метод разделяет в основном фрагменты, различающиеся соотношением оснований ( содержаниемGC ).

Было разработано бесчисленное количество способов окрашивания ДНК – как непосредственно в клетке, так и с помощью ДНК, выделенной в лабораторной посуде. Их часто используют в лабораториях в то время, когда это необходимо, например, в электрофоретическом геле или непосредственно в фиксированной ячейке для выделения ДНК. Известные такие красители включают (без логической последовательности): SYBR Green , YOYO-1 , TOTO-1 , TO-PRO , SYTOX Green , а также классический бромид этидия и йодид пропидия , акридиновый оранжевый , различные красители Hoechst или DAPI.

Добавить комментарий