Врожденный дискератоз, или ДК, – это редкое наследственное заболевание, для которого существуют ограниченные возможности лечения и нет лечения. Заболевание, которое обычно диагностируется в детстве, приводит к отказу стволовых клеток, что приводит к серьезным проблемам, включая недостаточность костного мозга, фиброз легких, дискератоз кожи, атрофию и воспаление кишечника. Пациенты также подвергаются повышенному риску развития нескольких типов рака.
Распространенным признаком заболевания является наличие укороченных теломер. Теломеры – это структуры, которые защищают или "шапка," концы хромосом, но они имеют тенденцию укорачиваться с возрастом и делением клеток и, таким образом, могут потерять свои защитные функции. Многие пациенты с ДК имеют мутацию в гене DKC1, который кодирует компонент фермента, называемого теломеразой, который помогает поддерживать длину теломер. Поскольку теломераза наиболее важна в тканях, которые часто делятся, особенно в эпителиальных тканях, таких как кожа, кишечник и легкие, именно здесь у этих людей возникают дефекты.
В новом исследовании, опубликованном в Cell Stem Cell, исследователи из Пенсильванского университета под руководством Кристофера Дж. Ленгнер из Школы ветеринарной медицины и Брэд Джонсон из Медицинской школы Перельмана обнаружили связь между теломерами и молекулярным сигнальным каскадом, называемым Wnt-путь, который может указывать на вариант лечения для пациентов с DC. Связь была первоначально идентифицирована с использованием мышей в лаборатории Джонсона, и вместе группы Ленгнера и Джонсона распространили эти результаты на человеческие ткани в культуре, чтобы продемонстрировать, что стимуляция пути Wnt обращает признаки дисфункции, связанной с DC, в кишечнике.
Их исследование подчеркивает наличие положительной обратной связи между передачей сигналов Wnt и функцией теломер, посредством чего стимуляция передачи сигналов Wnt активирует экспрессию белков, которые усиливают "шапка" на теломерах, что приводит к более функциональным стволовым клеткам, что, в свою очередь, стимулирует дальнейший путь Wnt.
Исследование также дает представление о стратегиях борьбы с дисфункцией теломер, процессом, который также был связан с некоторыми видами рака и естественным старением.
"То, что вы видите у мутантных мышей и пациентов с врожденным дискератозом, является следствием меньшей активности теломеразы в быстро делящихся тканях," сказал Джонсон, соавтор исследования и доцент кафедры патологии и лабораторной медицины Penn Medicine. "Это не то же самое, что естественное старение, когда у вас могут быть дефекты теломер в клетках, которые изначально не обладают большой активностью теломеразы. Но я думаю, будет справедливо сказать, что наши результаты дают представление о том, что может происходить, поскольку теломеры укорачиваются с возрастом."
Ленгнер, доцент кафедры биомедицинских наук Пенсильванского университета, был соавтором исследования.
"Сейчас основным лечением этих пациентов является пересадка костного мозга," Ленгнер сказал. "Это может решить проблему недостаточности костного мозга, но не решает других проблем, связанных с заболеванием, и особенно риска рака. Эта работа предлагает способ устранения основной причины заболевания."
Более ранние исследования с мышиными моделями DC предполагали, что может существовать связь между путем Wnt и теломеразой. А недавнее исследование клеток пациентов с DC обнаружило снижение активности пути Wnt. Поэтому исследователи из Пенсильвании хотели выяснить, может ли активация Wnt обратить вспять эффекты болезни.
Для этого команда использовала три зарождающихся метода. Во-первых, они использовали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или ИПСК, которые представляют собой взрослые клетки, которые "перепрограммирован" чтобы очень походить на эмбриональные стволовые клетки. Это позволило исследователям взять клетки у пациентов с ДК, а также у здоровых людей, и преобразовать их так, чтобы клетки, такие как стволовые, могли дать начало множеству различных типов клеток.
Во-вторых, они использовали систему CRISPR / Cas9, простой метод с драматическими эффектами. Подобно вырезанию и вставке для генома, он создает двухцепочечные разрывы в определенном участке ДНК, а затем восстанавливает его, включая новую желаемую последовательность, используя гомологичную рекомбинацию. Исследователи использовали эту систему редактирования генов для введения мутации DKC1 в ИПСК здорового человека, а также для исправления вызывающей заболевание мутации в ИПСК из образцов пациентов с ДК. Таким образом, они сопоставили наборы клеточных линий для тестирования, что могло исключить влияние любых фоновых генетических вариаций.
Наконец, исследователи вырастили то, что известно как "органоиды," рост in vitro, напоминающий орган, посредством процесса, называемого направленной дифференцировкой, при котором ИПСК питались определенными молекулами, имитирующими сигналы, которые стволовые клетки получают при нормальном развитии. В этом случае клетки были уговорены сформировать органоид кишечника человека, который естественным образом образует трубчатую структуру, повторяя трубки желудочно-кишечной системы человека.
Когда команда Пенна наблюдала за развитием органоида кишечника, они обнаружили, что первоначально клетки пациентов с DC, казалось, формировались нормально.
"Но в тот момент, когда они должны были образовать кишечник и образовать кишечную трубку, все развалилось," Ленгнер сказал.
В то время как образцы здоровых пациентов и образцы от пациентов DC, которые были скорректированы с помощью CRISPR, образовали пробирку, исходные клетки пациентов и клетки, в которых была введена болезненная мутация, введенная CRISPR, по-видимому, следовали нормальному курсу развития в течение нескольких дней. , но к двум неделям исчезла трубчатая структура, наблюдаемая в здоровых образцах и образцах с исправленным заболеванием. Эти клетки также имели более короткие теломеры, при этом кишечные органоиды пациентов с ДК имели самые короткие из всех типов клеток.
"Мы могли видеть на молекулярном уровне, что это сопровождается неспособностью активировать определенные программы генов стволовых клеток кишечника," Ленгнер сказал, "в частности гены пути Wnt."
Следующим логическим шагом для исследователей была активация Wnt, чтобы посмотреть, можно ли исправить эти дефекты. Они обработали органоиды, полученные из ИПСК пациентов с ДК, соединением под названием CHIR, которое стимулирует путь Wnt, и обнаружили, что оно восстанавливает образование трубчатой структуры, а также экспрессию генов стволовых клеток кишечника. Обработка также увеличила активность теломеразы и длину теломер в клетках с мутантным DKC1.
Чтобы оценить этот подход к лечению на более клинически релевантной модели, они трансплантировали органоиды кишечника человека мышам. Мыши, получившие трансплантат, содержащий мутацию DKC1, а также обработанные одобренным FDA стимулятором пути Wnt, литием, сохранили структуру своей ткани кишечника и имели высокую экспрессию генов-мишеней Wnt. По сути, они напоминали мышей, которым трансплантировали органоид, полученный от здорового пациента.
По словам исследователей, исследование предлагает доказательство принципа того, что активация пути Wnt может обратить вспять, по крайней мере, желудочно-кишечные фенотипы, связанные с врожденным дискератозом. Забегая вперед, они хотели бы попробовать совершить тот же подвиг на других типах тканей, пораженных болезнью, таких как легкие и даже кровь.
И хотя литий является одобренным лекарством, он не селективен в отношении пути Wnt и имеет побочные эффекты, и, следовательно, "скрининг дополнительных терапевтических агентов может быть полезным," Джонсон сказал.